Pesci usati come "avatar" per testare le cure

Tutto si svolge al primo piano della Fondazione Champalimaud, su un'isola e una panchina in mezzo ad altri progetti in corso, con vista sul giardino tropicale tra la clinica e i laboratori. La ricerca coinvolge un team di 10 persone, tra cui specialisti del cancro al seno e alle ovaie e informatici dedicati all'algoritmo di Intelligenza Artificiale in fase di sviluppo. Rita Fior , che dà il nome al laboratorio, guida il progetto "zAvatar" , uno studio dedicato alla creazione di un modello che preveda il tipo di trattamento oncologico più appropriato per il singolo tumore, senza sottoporlo a cicli di terapie "inutili" con effetti collaterali significativi.

"Il nome del progetto è stato dato dal ricercatore americano David Langer, che conosciamo anche in questo campo. All'epoca, lo chiamavamo Patient Derived Xenograft, PDX . Poi, non so perché, credo sia stato quando è uscito il film [ Avatar di James Cameron], che la gente ha iniziato a parlare di avatar", racconta la ricercatrice a Observador, spiegando il principio di base del suo esperimento : testare "su un avatar" invece che direttamente su una persona . "Dobbiamo vendere il prodotto, dobbiamo vendere la scienza", continua. A luglio, il team ha ricevuto un finanziamento di 100.000 euro dalla Lega Portoghese contro il Cancro, la somma più alta mai assegnata dall'organizzazione.

Che si tratti di PDX o di zAvatar, il nome non è la cosa più importante per Rita Fior. L'obiettivo attuale è l'utilizzo di embrioni di pesce zebra, che condividono circa il 70% dei geni con gli esseri umani , per testare l'efficacia di diversi trattamenti oncologici disponibili sul mercato per pazienti con tumore al seno e alle ovaie in fase avanzata. Il processo in sé è relativamente semplice in teoria, ma l'esecuzione è più complessa di quanto sembri. La specialista spiega che tutto inizia con la raccolta di cellule tumorali dai pazienti , parallelamente all'allevamento di questi pesci zebra in un'altra sezione della Fondazione Champalimaud.

Per raggiungere il "reparto maternità", bisogna scendere nel "seminterrato" della Fondazione Champalimaud, un'area in cui i protocolli di accesso sono rigidi. È obbligatorio indossare copriscarpe, camice sterile, cuffia per capelli, mascherine e guanti . La segnaletica sul pavimento delimita gli spazi in cui si può camminare con e senza protezione. Una volta equipaggiati, si percorre un lungo corridoio con porte che si aprono automaticamente all'avvicinarsi, a livello del mare e parallelo al fiume Tago. Non ci sono finestre, ma in lontananza si intravede una stanza in cui sono tenuti questi animali.

Tra le quattro mura che ospitano centinaia di vasche, ora è possibile rimuovere la mascherina, ma tutti gli altri strati protettivi rimangono al loro posto per evitare di interferire in alcun modo con i vari esperimenti che si svolgono simultaneamente in quella stanza. Il nome ufficiale è vivarium , stanze in cui vengono allevati diversi tipi di animali per scopi scientifici in ambienti altamente controllati. In questo caso specifico, ci sono circa 30.000 pesci zebra , l'unica specie presente nelle strutture visitate dall'Osservatore. Nelle stanze vicine, ci sono altre specie marine e topi, che non sono stati utilizzati nello studio in questione.

Tutte le condizioni sono controllate, dalla temperatura e dal pH dell'acqua, all'illuminazione della stanza, fino alla conduttività stessa , che viene gradualmente modificata per preparare i pesci ai lavori di ristrutturazione che avranno luogo nel vivarium ad agosto. "I lavori emetteranno suoni e vibrazioni, e quindi ne anticipiamo gli effetti, che potrebbero causare un certo stress negli animali", spiega Joana Monteiro, responsabile della Piattaforma Ittica della Fondazione, sottolineando che i pesci zebra "hanno un'ottima capacità di adattarsi gradualmente a diverse condizioni", a differenza di potenziali agenti patogeni che potrebbero annidarsi nelle vasche durante questo periodo. A tal fine, continua la specialista, mescolano anche un po' di acqua salata all'habitat prevalentemente dolce dei pesci, in modo che possano gestire il cambiamento senza problemi.

Ci sono tre isole, sei lati riempiti da queste vasche blu. A piena capacità, ciascuna di queste piccole vasche contiene 35 pesci zebra adulti , ma molte di esse non sono piene. Questi adulti vengono generalmente nutriti a mano due volte al giorno con un crostaceo chiamato artemie, fatta eccezione per alcuni casi sperimentali, che vengono nutriti tre o quattro volte al giorno, con una dieta diversa da quella dei loro vicini. L'isola in fondo alla stanza ospita le "larve" appena arrivate dal "reparto maternità".

Questi, che possono essere distribuiti in quantità maggiori nelle vasche, vengono trattati in modo diverso rispetto ai pesci adulti. Questa fase di crescita, la transizione da embrione ad adulto, dura circa tre mesi. Durante questo periodo, i "piccoli" e i "piccoli" mangiano quattro volte al giorno – due volte cibo liquido, due volte cibo in polvere – ma in un regime "semi-autonomo". A differenza degli adulti, che vengono nutriti dai tecnici della Piattaforma, le "larve" vengono alimentate da un robot che legge i codici QR posizionati nelle vasche, trasmettendo informazioni sul numero di pesci presenti e sul cibo necessario per nutrirli.

"Il cibo secco è ciò che mangiano ogni giorno. Mantenere cibo vivo è un buon arricchimento ambientale perché permette loro di mantenere un naturale istinto predatorio , il che è positivo per i pesci stessi, non solo per la loro salute, ma anche per il mantenimento di normali risposte neurologiche", spiega Joana Monteiro, osservando che questo "arricchimento ambientale" contribuisce anche alla "felicità" dei pesci.

Secondo il responsabile della Piattaforma, " ci sono circa 300 linee geneticamente modificate " nelle tre isole che compongono il vivarium. "Sono tutti pesci zebra", ma entrando nella stanza è possibile notare alcune nette differenze tra i vari pesci: "Alcuni hanno pigmenti striati, altri sono rosa". Le strisce sono simili a quelle della zebra, da cui il nome dato a questa specie. Tuttavia, alcuni sono stati allevati con una mutazione che impedisce la formazione di pigmenti neri, ottenendo una colorazione uniforme senza le strisce che caratterizzano il pesce.

Questa differenziazione estetica è estremamente importante per diverse ragioni sperimentali. Spesso, i maschi presentano un colore diverso, le femmine un altro, o persino, all'interno dello stesso esperimento, in due linee cellulari diverse, questa variazione di pigmento viene utilizzata per facilitarne l'identificazione. Durante la riproduzione, questo fenomeno è più evidente, soprattutto perché maschi e femmine sono separati all'interno della stessa vasca.

I pesci vengono collocati in contenitori separati, dotati di un divisorio – i maschi da un lato, le femmine dall'altro – in modo che i ricercatori abbiano il controllo completo sul processo e sappiano esattamente quando vengono deposte le uova . "Quando fa buio, le luci vengono spente e nessuno entra nella stanza. Solo durante il giorno, verso le otto del mattino, le luci vengono riaccense e, con lo stimolo che indica che è giorno, inizia il processo di riproduzione", spiega Joana Monteiro, indicando che è in questo momento che i ricercatori iniziano a monitorare questi pesci selezionati per osservare l'accoppiamento. " Il maschio tocca il ventre della femmina con la coda e poi rilascia le uova ", continua.

In circostanze normali, i pesci zebra spesso mangiano alcune delle proprie uova dopo che sono state deposte dalla femmina. Pertanto, per contrastare questo stimolo caratteristico, viene posizionata una rete che permette alle uova di passare verso un'altra partizione inaccessibile al pesce, garantendo così il pieno mantenimento di tutta la prole. Ogni coppia è in grado di produrre tra le 100 e le 200 uova alla volta, a volte arrivando a deporne fino a 500. Sul fondo di queste vasche di riproduzione, utilizzano immagini di rocce – simili al loro habitat naturale – "come forma di arricchimento durante la riproduzione", sebbene non vi siano prove che "dimostrino definitivamente che questa sia una soluzione migliore", ma ci sono "indicazioni" che sia benefica.

Per visitare gli embrioni appena schiusi, bisogna recarsi in un'altra stanza, a pochi passi di distanza, e quindi indossare nuovamente la mascherina. Questa seconda stanza è composta da due banchi, con microscopi a fluorescenza e incubatori, dove vengono conservati gli embrioni. È in questa stanza che vengono eseguiti ulteriori screening per identificare le mutazioni genetiche desiderate. È sempre in questa stanza che rimangono fino a quando non vengono ufficialmente classificati come animali . "A cinque giorni iniziano a nutrirsi esternamente, ed è anche l'età legale in cui diventano animali protetti dalla legge che protegge i vertebrati utilizzati nella sperimentazione", continua lo specialista durante la visita a Observador, spiegando che durante questo periodo, fino al passaggio alla "maternità", i pesci si nutrono del "tuorlo" sotto la testa, che si restringe man mano che lo consumano, finché non raggiungono il punto in cui possono nutrirsi esternamente.

Tornando nell'ufficio con vista sul fiume Tago della ricercatrice principale del progetto "zAvatar", Rita Fior spiega perché si stanno concentrando sulle cellule di pazienti affette da tumore al seno e alle ovaie. "In questi tipi di tumore, spesso si accumulano fluidi che devono essere drenati dai pazienti per alleviare i sintomi, ma poi finiscono nella spazzatura", spiega la ricercatrice, aggiungendo che "questi fluidi contengono molte cellule tumorali". Pertanto, nel tentativo di ridurre il numero di procedure a cui i pazienti si sottopongono, il gruppo di ricerca utilizza questo "materiale che sarebbe stato comunque rimosso dal paziente", il che si traduce anche in una riduzione dei costi operativi , oltre che in preoccupazioni etiche.

Una volta raccolti i campioni necessari, il passo successivo è somministrare il materiale canceroso a "larve" o embrioni di pesce zebra , che assimilano rapidamente il tumore e consentono di osservare la progressione del cancro in un periodo di tempo molto breve. Questo permette loro di iniziare a testare procedure terapeutiche sui pesci. "Un altro motivo per cui utilizziamo questo tipo di cellule tumorali è perché, in questo contesto, quando i tumori sono molto avanzati e metastatici, sono disponibili diverse opzioni terapeutiche", afferma Rita Fior, osservando che questi sono gli scenari che causano la maggiore incertezza nella pratica clinica e spesso finiscono per sottoporre i pazienti a più cicli di trattamento che non producono l'effetto desiderato, finché non trovano l'opzione più appropriata .

"Testiamo [le opzioni terapeutiche] che i medici hanno a disposizione", continua, affermando che in questo modo possono, fin dall'inizio, liberare il paziente da tutti gli effetti collaterali associati alle diverse terapie utilizzate, senza ottenere l'effetto terapeutico desiderato, sapendo a priori quale sarà il trattamento più efficace per il tumore specifico di ciascuno di loro, in modo personalizzato.

Le "larve" sono quasi invisibili a occhio nudo. Quando manipolano le loro cellule, che si tratti di somministrare un cancro o un trattamento, i ricercatori utilizzano lenti di ingrandimento e microscopi ultraspecializzati. "Senza immunofluorescenza, non possiamo vederle", esclama la ricercatrice Bruna Costa, mentre cerca di spiegare a Observador le immagini sullo schermo del computer, collegato a un microscopio confocale a basso costo del valore di circa 250.000 euro . Questo dispositivo ha una risoluzione superiore a qualsiasi altro in laboratorio – nonostante "altri, più costosi, presenti presso l'Istituto" – il che consente la risoluzione a livello di singola cellula , cellule individualizzate e conclusioni migliori sugli effetti dei trattamenti.

Dall'altro lato del banco, dove si trovano le lenti di ingrandimento "più semplici" e a bassa risoluzione, la co-ricercatrice principale Marta Estrada spiega che utilizzano "piastre di agar", un "tipo di gelatina" utilizzato per "allineare i pesci" e facilitare il processo di somministrazione del farmaco, poiché sono tutti aggregati in un'unica "linea". Osservando l'immagine proiettata dalla lente di ingrandimento a fluorescenza accanto al microscopio confocale "super", si può ancora vedere l'embrione vivo, con il suo cuore pulsante .

"I laser sono tossici, quindi quando puntiamo un laser molto potente su un pesce per 10 ore, si verificherà una tossicità", continua la ricercatrice Marta Estrada, che spiega che la proprietà dei " dischi rotanti " (dischi rotanti che consentono di catturare rapidamente più immagini in posizioni diverse) presenti in questo "super" microscopio, permette di ridurre significativamente la tossicità, aprendo la strada a osservazioni "spettacolari".

"Qui realizziamo video incredibili. I pesci vivi vengono tenuti sotto osservazione per tutta la notte – 10, 12 ore – e osserviamo come il loro sistema immunitario interagisce con le cellule tumorali , come metastatizzano, ecc. Questo non è possibile con i topi, perché sono molto più grandi e non trasparenti come le larve", aggiunge. Se dovessero usare topi, meglio conosciuti come ratti da laboratorio, questo stesso processo "richiederebbe mesi" e sarebbe più complesso da monitorare, richiedendo interventi successivi sugli animali. Quindi, l'intero processo richiede solo 10 giorni, dalla nascita del pesce fino all'ottenimento di un risultato conclusivo sul trattamento più efficace per il caso specifico in analisi.

Non viene utilizzato un solo embrione per trattamento, spiega la ricercatrice Raquel Mendes , mentre estrae i pesci da un vetrino per esaminarli in seguito. "Usiamo tutto ciò che possiamo dal campione del paziente e iniettiamo tutto nei pesci che abbiamo", dice, notando che "durante la terapia, molti finiscono per morire" e anche che a volte, durante la somministrazione del farmaco, non si riesce a "iniettare il pesce nel punto giusto", con conseguente "perdita di pesce".

Proprio perché si verificano così tante perdite durante il processo, la ricercatrice sottolinea la necessità di avere "molti pesci da dividere in controlli, più terapia A, terapia B, terapia C, ecc." Oltre all'importanza di garantire almeno un risultato conclusivo, Raquel Mendes aggiunge che è meglio avere a disposizione un gran numero di pesci, per dimostrare ai medici che i risultati ottenuti sono significativi, avendo una maggiore "fiducia statistica".

Dato il notevole potenziale dimostrato da questa metodologia, sono in corso collaborazioni con altre istituzioni e ricercatori di numerosi Paesi, sia per approfondire gli argomenti in fase di sviluppo, sia semplicemente per "insegnare i trucchi" ad altri laboratori.

"Abbiamo ricevuto diversi progetti di collaborazione, con studenti che vengono qui per imparare", afferma Rita Fior, responsabile del progetto. L'iniziativa nasce da un progetto europeo, che partecipa al finanziamento dello studio, che consente ai ricercatori di un laboratorio in Serbia di recarsi a Lisbona per apprendere le tecniche utilizzate dal team della Fondazione Champalimaud. "L'anno scorso abbiamo tenuto un corso di una settimana con otto studenti provenienti da tutto il mondo – uno dall'India, un altro dal Cile – che vengono qui solo per imparare", ricorda. "Ci sono molti trucchi. Sembra facile, ma non lo è", aggiunge.

Oltre agli studenti internazionali desiderosi di imparare, esiste una forte collaborazione interistituzionale. L'esempio migliore è la piccola suddivisione del team dedicata esclusivamente allo sviluppo dell'algoritmo di intelligenza artificiale, il cui obiettivo principale è ridurre i tempi di elaborazione complessivi da 10 giorni a "cinque o sei".

Questo sottoteam è composto da due membri: Estibaliz Gómez-de-Mariscal , ricercatore spagnolo presso l'ITQB, e Martim Gamboa. Studente magistrale presso la Facoltà di Scienze e Tecnologia dell'Università NOVA di Lisbona, funge da ponte tra i laboratori di Oeiras e Champalimaud. "Martim è il nostro specialista IT; è lui che gestisce l'IA", spiega Rita Fior.

Questa parte del progetto ha avuto diversi inizi, ognuno dei quali ha incontrato ostacoli, dovuti sia ai limiti personali degli esperti che all'inefficacia degli algoritmi sviluppati. Tuttavia, quest'ultimo anno di test si è rivelato molto promettente, tanto che il 20 giugno ha ricevuto un finanziamento per la ricerca dalla Lega Portoghese contro il Cancro, del valore di 100.000 euro , il più grande finanziamento mai concesso dall'organizzazione .

"Questa ricerca rappresenta un significativo progresso nel campo dell'oncologia personalizzata, combinando modelli biologici innovativi con l'intelligenza artificiale per accelerare l'identificazione di terapie efficaci , adattate al profilo di ciascun paziente", ha sottolineato l'organizzazione in una nota inviata alle redazioni, osservando che questo finanziamento "Ricerca oncologica nell'era dell'intelligenza artificiale" rappresenta una "pietra miliare nella sua storia", non solo per il suo valore, ma anche per il suo obiettivo di "sostenere progetti scientifici di eccellenza che combinano la ricerca oncologica con il potenziale dell'intelligenza artificiale per migliorare l'assistenza sanitaria, la diagnosi precoce e i trattamenti personalizzati".

In poco più di un anno, il prototipo attuale può già raggiungere approssimazioni tra il 70% e l'80% della metodologia manuale , afferma Martim Gamboa a Observador. Ciononostante, pur prevedendo un'automazione "più robusta e veloce" dell'analisi dei risultati con gli strumenti di intelligenza artificiale sviluppati, i responsabili del progetto sottolineano che il " controllo di qualità " umano sarà sempre necessario per garantire l'affidabilità dei risultati.

Il finanziamento ha una durata di due anni e, in concomitanza con l'avvio delle sperimentazioni cliniche, Rita Fior sottolinea l'importanza che i dati ottenuti avranno per l'ulteriore sviluppo dell'algoritmo in questo periodo.

Fondamentale per il successo di questa ricerca, Rita Fior spiega che, oltre a spiegare il processo sperimentale, sono necessari una serie di criteri per ottenere l'autorizzazione all'utilizzo di questi animali in un contesto scientifico. La direttiva europea che regola questa pratica è stata sviluppata sulla base delle "tre R". Non i tradizionali "Riciclare, Rinnovare e Riutilizzare", bensì "Sostituzione, Riduzione e Raffinamento".

Pertanto, l'Unione Europea richiede che, prima dell'approvazione, i ricercatori determinino se possono "sostituire" l'uso di animali nei loro progetti con altri metodi o approcci che non lo richiedano. Analogamente, la riduzione richiede l'utilizzo del numero minimo possibile di animali e, secondo il portale ambientale del diritto dell'UE , per "raffinamento" si intende "modificare qualsiasi procedura dalla nascita fino alla morte di un animale, per minimizzarne la sofferenza e aumentarne il benessere".

Questa normativa, implementata ai massimi livelli europei, viene tenuta in considerazione anche internamente, presso la Fondazione Champalimaud stessa. "Dal punto di vista legale, tutto ciò che facciamo qui è strettamente regolamentato. Tutti i ricercatori i cui progetti sono approvati dall'autorità per il benessere degli animali devono essere approvati internamente ", afferma Joana Monteiro, responsabile della Piattaforma Ittica dell'istituto, che coordina anche l'autorizzazione all'uso di animali a fini scientifici.

Prima dell'approvazione, la Piattaforma deve chiedersi "perché viene fatto con gli animali", "a quale scopo" e "se il progetto può procedere senza sacrifici animali". Una volta ottenuto il via libera interno, la proposta viene inoltrata alla Direzione Generale per gli Affari Alimentari e Veterinari (DGAV) , che concede l'autorizzazione definitiva secondo i criteri europei. Ciononostante, la Piattaforma, gestita internamente, è responsabile di garantire che la ricerca non si discosti dalle normative. "Vi è un monitoraggio dell'aspetto tecnico, anche durante il lavoro sperimentale", ammette Joana Monteiro, sottolineando di consigliare spesso i ricercatori sulle migliori pratiche per l'uso degli animali nella ricerca.

La responsabile dichiara inoltre a Observador di non aver mai dovuto rifiutare un progetto di questa natura. "Al massimo, possiamo discutere sul numero di animali, se ridurne o usarne solo la metà, se usare un altro approccio, anche nel metodo sperimentale", continua, ma assicura che "i ricercatori sono già consapevoli" di evitare l'uso di animali se non è assolutamente necessario . Nel caso del progetto "zAvatar", non c'erano davvero alternative, eppure Rita Fior, la responsabile del progetto, garantisce che ogni passo venga compiuto con la massima umanità possibile .

"Quando iniettiamo [le cellule tumorali], i pesci vengono anestetizzati e si muovono solo dopo un po' di tempo sotto l'effetto dell'anestetico. Ci prendiamo cura di loro con grande attenzione", assicura la ricercatrice, in linea con le istruzioni lasciate da Joana Monteiro: "Prima prendono un Ben-u-ron – la versione per pesci – poi l'anestesia, e solo dopo questi passaggi viene eseguita la procedura . E poi prendono un altro antidolorifico per la convalescenza".

Rita Fior sottolinea che, tecnicamente, gli embrioni utilizzati nel suo laboratorio non sono classificati come animali, poiché vengono utilizzati prima dei cinque giorni di età, la soglia richiesta dall'Unione Europea. Nonostante questa "zona grigia" nelle linee guida, la ricercatrice assicura che "indipendentemente dal fatto che siano considerati animali o meno", vengono sempre sottoposti a "una serie di precauzioni per ridurre al minimo la sofferenza dell'animale".